大量の生物学的サンプルの調製

May 05, 2023

Nature Protocols volume 18、pages 1441–1461 (2023)この記事を引用

1781 アクセス

1 引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

健康な臓器の形態や病態生理学的変化を理解するには、さまざまなスケールでの画像化が不可欠です。無傷の人間の臓器を含む大きなサンプルのマクロスケールおよびミクロスケールの三次元形態は、X 線マイクロトモグラフィー (実験室用またはシンクロトロン線源を使用) で可能です。しかし、高解像度イメージング用の大きなサンプルの準備は、サンプルの収縮、不十分なコントラスト、サンプルの移動、マウントまたはスキャン中の気泡の形成などの制限により困難です。ここでは、X 線マイクロトモグラフィー用の大きな軟組織サンプルの準備、安定化、脱水、およびマウントについて説明します。欧州放射光施設で人間の臓器全体と階層的位相コントラスト断層撮影に適用されるプロトコルを詳しく説明しますが、完全な生物を含むさまざまな生物学的サンプルに適用できます。このプロトコルは、X 線イメージングを使用する際のコントラストを強化し、サンプルの向きが異なる場合でもスキャン中のサンプルの動きを防ぎます。取り付け中に閉じ込められた気泡や、スキャン中に形成された気泡（シンクロトロン X 線イメージングの場合）は、複数の脱気ステップによって軽減されます。サンプル前処理は、磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影法、組織学的観察にも対応しています。人間の脳全体や心臓などの大きな臓器の場合、サンプルの準備と取り付けには 24 ～ 36 日かかります。準備時間は組織の組成、サイズ、脆弱性によって異なります。このプロトコルを使用すると、局所ボクセルサイズ 1 μm で直径 150 mm の無傷の臓器のスキャンが可能になります。このプロトコルでは、人間または動物の臓器の取り扱い、実験室での操作、X 線画像処理などの専門知識を備えたユーザーが必要です。

健康と病気の両方における人間の器官形態の定量化は、次元スケールをまたがるマルチモーダル空間イメージングモダリティによって取り組むことができる複雑なタスクです。完全な組織形態学的特徴付けには、スケール間およびスケール間の相互作用の検出が必要です。ただし、ほとんどのイメージング技術は解像度または視野によって制限されているため、巨視的観察と顕微鏡的観察およびデータの橋渡しが困難です。従来の組織学 1、2、3 または電子顕微鏡法 4、5、6 のアプローチでは、連続切片を通じて組織の微細構造組織と組成を視覚化でき、データを適切に定量化できます。しかし、これらのアプローチは通常、組織のサンプリングと切片化を必要とし、非常に労力と時間がかかります。光学的透明化とライトシート顕微鏡検査を組み合わせると、高解像度で広い視野が得られます。ただし、組織の除去には長い時間が必要であり、多くの場合費用がかかります。さらに、ライトシート顕微鏡の結像深度は、対物レンズの作動距離によって制限されます7、8。成人の人間の臓器全体 8 や動物の臓器全体 9 が数か月かけて採取された場合でも、それらを画像化することは依然として困難です。同様の欠点は、光コヒーレンストモグラフィー 10,11、多光子顕微鏡法 12、または共焦点顕微鏡法 13,14 にも当てはまります。これらは、細胞スケールで組織の局所的な三次元 (3D) 微細構造を捕捉することができますが、組織浸透が限られており、深部組織のイメージングを妨げます 15。最近、高解像度磁気共鳴画像法 (MRI) により、生体外の人間の脳全体で 100 μm の等方性ボクセルサイズが達成されました 16。 MRI は非破壊的で広い視野を持っていますが 17、分解能は組織の微細構造を検査するにはまだ十分ではありません。階層イメージング技術は、解像度と視野の間のトレードオフを克服できます。階層的アプローチでは、同じサンプルの複数の画像が異なる解像度で取得され、異なるスケールを橋渡しします。マイクロコンピューター断層撮影法 (μCT) を使用して肺全体を 150 μm ボクセルの解像度で画像化し、続いて肺内の生検コアを抽出します。次に、これらの小さなコアをμCTでスキャンして、10 μmのボクセルを実現しました18。

X 線イメージングの分野では、過去 10 年間で、特に軟組織の可視化において大幅な進歩が見られました 19。シンクロトロン X 線コンピュータ断層撮影 (sCT) は、その高輝度 20 により、最も強力な X 線ベースのイメージング技術の 1 つであることが証明されており、軟組織を高解像度で観察でき、微細構造成分を検出するのに十分なコントラスト 21 を実現します。個々のニューロン22またはエラスチン線維23として。特に、最適化されたサンプル調製および取り付け手順と組み合わせた位相コントラストベースの sCT24 は、心臓線維の配向 25,26 と、別途脳細胞マップ 27 に関する広範な情報を提供しています。位相コントラストイメージングとは、サンプルによって与えられた X 線ビームの位相シフトの検出を指します 28。この技術により、造影剤が存在しない場合には従来の X 線断層撮影法では検出できなかった軟組織の視覚化が可能になります 29。それにもかかわらず、sCT を使用した研究は、視野が限られているため、胎児の臓器 30、成人の臓器の小さなサブサンプル 31、または小動物モデル (マウス 32 やウサギ 33 など) の臓器にほとんど限定されています。いくつかの研究では、直径 10 cm、高さ 30 cm に達するシーラカンスなど、より大きなサンプルの画像化が実証されています 34,35。ただし、ボクセルサイズは 30 μm に制限されており、対象となる構造は硬組織または軟骨でした。

欧州シンクロトロン放射施設 (ESRF) の非常にブリリアント光源などの第 4 世代シンクロトロン光源は、マクロスケールからミクロスケールまで無傷の人体臓器を可視化するのに十分なビーム空間コヒーレンスと光束を提供します。 ESRF の非常に優れた光源を使用して、我々は最近、階層的位相コントラスト断層撮影法 36 (HiP-CT) と呼ばれる技術を開発しました。これにより、約 20 µm の等方性ボクセルで無傷の大きな人間の臓器をスキャンし、その後のズーム (切片化なし) により、局所的に1μmまでの等方性ボクセル。見落とされがちですが、特にボクセルサイズと臓器直径の比が 1:150,000 (1 μm) である人間の臓器などの大きな軟組織サンプルを視覚化する場合、サンプルの準備と取り付けは、この技術や他の技術で最高の解像度を達成するために非常に重要です。 150mm）。撮像可能な最大直径は、X線ビームの幅、検出器のサイズ、データの再構成に利用できる計算能力、データのサイズなど、ビームラインの機器および設定パラメータによって制限されます。現在、我々が撮影した臓器の最大直径は 150 mm ですが、現在のセットアップでは直径 250 mm、垂直方向 500 mm まで互換性があります。

これらすべての実験手法が成功するかどうかは、画像アーチファクトを回避するためのサンプルの慎重な準備にかかっています。 μCT または sCT を使用した軟組織イメージングには、硬組織と比較して多くの課題があります。これらの問題の 1 つは、サンプルの成分の密度が似ているため、X 線で画像化するときにコントラストが欠如することです。さらに、X 線投影から 3D ボリュームを再構成するために通常使用される逆投影アルゴリズムは、スキャン中にサンプルが移動しないことを前提としています。ほとんどのサンプル前処理方法は、サンプルのドリフトや変形を防ぎ、画像の品質を低下させる動きによるアーティファクトを避けるように設計されています37。動き補償 38,39 や機械学習ベース 40,41 などの一部の再構成アルゴリズムは、この問題を克服するために開発されました 42 が、依然として複雑で運用コストが高くつきます 19。

私たちが説明するプロトコルは、さまざまなサイズとさまざまなイメージングモダリティを使用する幅広い生物学的サンプルに適用できますが、ここではシンクロトロン位相コントラストイメージングを使用してイメージングされるサンプルに焦点を当てます。この方法は他の画像モダリティにも適用できます。ただし、選択したサンプルサイズとモダリティに応じて手順を最適化する必要がある場合があります（最適化の推奨事項についてはプロトコルの手順を参照してください）。

ここで説明するサンプルの準備と取り付けプロトコルは、無傷の人間の肺、脳、心臓、腎臓、脾臓などの大きな生物学的ボリュームを画像化する必要性から開発されました。この技術により、25 μm の等方性ボクセルサイズで臓器全体をスキャンできます。その後、生検を必要とせずにさらに高解像度のスキャンを行う領域が選択されます。このような大きな構造を画像化するには、高エネルギーの X 線ビームがサンプルを透過する必要があります。臓器イメージングには 64 ～ 120 keV のエネルギー範囲の多色ビームを使用しましたが、可能であればより高いエネルギー (最大 140 keV) が最適です。

スキャン中の密度の不均一性、気泡、または動きにより画質が大幅に低下するため、この技術では臓器の準備と安定化が不可欠です。この方法の開発中に、拡張データの図 1 で説明されているように、いくつかの課題が発生しました。気泡の閉じ込め (マウント中) と気泡の形成 (スキャン中) は、どちらもモーションブラーや位相コントラストアーティファクトを引き起こし、スキャンの品質を低下させます。この問題は、サンプルによって吸収される線量を制限し、臓器の準備および取り付け手順中に複数の脱気ステップを含めることによって解決されました。特にサンプルが大きいため、スキャン中のサンプルの移動はさらなる課題であり、画像化に長時間 (>5 時間) を必要とすることがよくあります。この課題は、砕いた寒天ゲルと液体 (この場合はエタノール 70%) の混合物を封入剤として臓器の周囲に注意深く詰めることで解決されました。さらに、エタノールによる臓器の脱水により、画像のコントラストが増加し 43、気泡の形成が減少しました。

ここでは、古典的なパラフィン包埋組織学の最終段階と互換性のある、sCT、μCT、医療用 CT、および MRI によるイメージング用に人間の臓器全体を準備する手順を紹介します。このプロトコルでは、主にサンプルの準備とエタノール寒天によるマウントについて説明します。 HiP-CT を使用した X 線イメージングプロトコルとその医療用途への応用 (コロナウイルス感染症 2019 (COVID-19) が肺血管系に与えるダメージの定量化) 44,45。簡単に言うと、身体の固定（ステップ 1A(i)）後、臓器の摘出（ステップ 1A(ii–iii)）、浸漬固定（ステップ 2）、真空による脱水および脱気（ステップ 4A）、または脆弱性に応じて熱サイクル（ステップ 4B）、粉砕寒天ゲル混合物（ステップ 5 ～ 33）でマウントし、sCT（ステップ 34 ～ 54）、μCT（ステップ 55）、臨床 CT（ステップ 55）および MRI（ステップ）を使用して画像化します。５５）、最後に組織学的分析が実行される（ステップ５６）。手順の概要については、図 1 を参照してください。

このプロトコルには、色分けされたボックスで示される 3 つの主要なステップ (臓器の取得と準備、臓器の取り付け、イメージング) が含まれています。臓器は、バイオバンク、手術、却下された移植から回収されることもあれば、提供された遺体から抽出されることもあります。臓器の脆弱性に応じて 2 つの脱気プロトコル (真空脱気と熱サイクル脱気) を提供します。サンプルを寒天ゲルにマウントすると、さまざまなイメージング技術 (μCT、sCT、臨床 CT、MRI) を実行できます。画像化後、サンプルの組織学を実行できます。

このプロトコルは、図 2 に示すように、HiP-CT で高解像度で画像化する人間の臓器全体を準備するために開発および最適化されており、脳、心臓、肺、腎臓、脾臓などのさまざまな臓器に適用されています。それにもかかわらず、臓器の準備手順は柔軟であり、動物由来の軟組織や無傷の小動物にも使用できます。この方法で画像化された人間の臓器および生体サンプルのリストと各ステップの準備時間は、拡張データ図 3 に示されています。X 線イメージングのための最も一般的なサンプル前処理方法には、固定、アルコール脱水、パラフィン包埋、または臨界点法が含まれます。乾燥中。アルコール浸漬などの湿式包埋の主な欠点の 1 つは、サンプルのドリフトであり、これにより動きのアーティファクトが生じます 37。パラフィン包埋と臨界点乾燥により試験片の構造が変化して剛性が高まり、試験片を長期間動かないようにすることができます。

a、ESRF のビームライン BM05 を使用して画像化された人間の心臓の 3D ビュー。 b〜d、等方性ボクセルサイズが25μm（b）、6.5μm（c）、2.5μm（d）の心臓の断面。 e、観察された主要な構造に関する注釈付きの2.5ボクセル画像の拡大図（ca、冠状動脈、mc、筋細胞、ad、脂肪組織）。この臓器の起源となる患者に関するすべての基本情報は、拡張データ図 2 に示されています。すべての実験は、人体実験に関する関連する政府および施設の倫理規制に従いました。

このプロトコルでは、サンプルの移動は、封入液と密度平衡にある寒天ゲルと砕いた寒天ゲルの小さなブロックを使用することによって防止され、サンプルを所定の位置に保持します。臓器安定化プロトコルで調製した同じサンプルで数か月間隔でスキャンしたものは、手動の剛体変換を使用して簡単に登録できます。これは、この方法が長期間にわたって安定していることを示しています。これらすべてのサンプル前処理方法に共通する問題は、組織の収縮です。この影響により、形態学的定量化が妨げられ、誤った分析につながる可能性があります。ただし、パラフィン包埋 46,47 や臨界点乾燥 37,48 と比較して、このプロトコルのサンプル収縮は、エタノール濃度 43 を 70% まで上昇させながら複数のエタノール浴を使用することで緩和できるため、組織の形態が保存されます。さらに、エタノールによるサンプルの脱水により、μCT43、49 または sCT50 とのコントラストがより高くなります。この標本調製プロトコルは、多くの MRI、臨床 CT、組織学 (3D イメージングおよび取り外し後) 技術と互換性があります。最後に、特定のイメージング機器は特殊化されている可能性がありますが、準備プロトコルは適切なドラフトを備えた生物学的研究室で実行できます。機器と材料は標準的な科学供給業者から容易に入手できますが、最も特殊な機器は真空ポンプとデシケーターチャンバーです。

この手順には他のサンプル前処理プロトコルと比較していくつかの利点がありますが、いくつかの制限に注意する必要があります。

固定と脱気を含むプロトコルのさまざまなステップのタイミングは、組織の組成とサイズに大きく依存します。この手順では、人間のさまざまな臓器のタイミングの例を示します。一方、他のタイプの組織のタイミングはテストして検証する必要があります。このプロトコルでは、タイミングの最適化に関するいくつかのガイドラインが提供されています。

臓器の固定は組織の長期保存にとって重要ですが、組織の機械的特性 51,52 や拡散特性が変化し、他の測定を混乱させる可能性があります。画像のコントラストは向上しますが、エタノール脱水は組織の機械的特性にも影響を与えます 43,53。これにより、この準備方法の現場試験への使用が制限されます。ただし、組織を固定せず、エタノールを水に置き換えることにより、in situ イメージングを使用することが可能になります 13,54。したがって、プロトコルは将来的には、動的実験や短期間での機械的特性の定量化（生物学的分解が発生するため）をカバーするように拡張される可能性があります。エタノールによるコントラストが十分に高くない場合、または実験のニーズに適合していない場合は、ヨウ素ベース 55 やタングステンベースの造影剤 56 などのさまざまな造影剤を使用して、組織全体のコントラストを高めたり、特定の成分を分解したりできます。興味深い13,56。寒天ゲルが特定の用途に望ましくない場合は、封入液と平衡状態にあり、その構造が比較的非晶質である他の固体または弾性媒体で置き換えることができます。例えば、96%エタノールで実装する場合、寒天ゲルの代わりに透明なキャンドルクリスタルゲルを使用することもできます。水実装の場合はゼラチンブロックやポリアクリルアミドブロックも使用できます。

湿式包埋法の主な欠点の 1 つは、sCT57 の場合、線量率または線量の蓄積による気泡の形成です。これらの気泡はサンプルを動かしたり損傷したりする可能性があるだけでなく、強いアーチファクトを生成して画質を大幅に低下させる可能性があります58。パラフィン包埋などの他の標準的な調製方法では泡立ちが問題になりますが、臨界点乾燥では泡立ちは発生しません。このプロトコルでは、手順中に複数の脱気ステップを実行することで問題が軽減され、スキャン中の気泡の核生成が遅延され、強い位相コントラストを持つ高エネルギー X 線の使用によってさらに軽減されます。しかし、十分なコヒーレンス特性と伝播能力を備え、高エネルギーで軟組織を画像化できるビームラインはほんのわずかしかありません。空間コヒーレンスは、幾何学的なぼやけを生じることなくサンプルの密度変化を区別できるように伝播距離を設定できるほど十分に高くなければなりません。低エネルギー X 線断層撮影の場合、水分子の光解離のため、脱気ステップは慎重に実行する必要があり、線量率はさらに慎重に制御する必要があります。

生体組織は様々な方法で採取することができる。サンプルがバイオバンク、手術、または中止された移植から直接収集された場合 (ステップ 1B)、サンプル固定段階 (ステップ 2) に直接持ち込むことができます。臓器が提供された身体からのものである場合、臓器摘出を実行する必要があります (ステップ 1A(ii))。遺体の防腐処理は、死後すぐ、臓器摘出の前に（資格のある医師によって）行われます。ラノリンを含む溶液で希釈したホルマリンを右頸動脈に注入することにより、身体を固定する（ステップ１Ａ（ｉ））。内臓を摘出した後、臓器を 4% 中性緩衝ホルムアルデヒドに浸漬することで臓器を完全に固定します (ステップ 2)。固視の持続時間は臓器のサイズによって決まります (たとえば、人間の脳の場合は 4 日)。臓器を内臓除去するときは、臓器への固定剤の浸透時間を短縮するために、周囲の組織をできるだけ多く除去するようにしてください。固定剤の量も重要です。組織量の少なくとも 4 倍の量をお勧めします。

肺などの一部の臓器では、膨張が必要な場合があります。これは、固定段階で制御された圧力下で肺にホルマリンを点滴注入することによって部分的に達成できます59。肺は、３０ｃｍの水柱を使用して気管を通して４％ホルマリンで灌流され、その後、気管を結紮して膨張した形状を２日間にわたって維持することができる。肺は抽出後、4% ホルマリン溶液に浸漬されます。固定されると、真空ポンプによる連続的なエタノール浴によるホルマリンの置換と、気管支へのエタノールの注入が組み合わされて、一貫した 3D 形状が維持されます。エタノール脱気による厳密に制御された圧力は、提案されたプロトコルでは現在不可能ですが、制御された圧力で注入された脱気エタノールの循環を使用すれば可能になるはずです。私たちの結果は、エタノール脱水段階で厳密に制御された膨張を行わなくても、データが依然として高い科学的有用性を持っていることを示しています。

臓器は、事前に脱気されたエタノール浴を複数回使用して脱水されます。収縮を避けるために、70% エタノールへの移行は徐々に行う必要があります 43。制御された収縮と、位相差を使用して目的の構造を観察するのに十分なコントラストとの間の最良の妥協点として、70% のエタノール濃度が選択されました。ただし、用途に応じて、異なる最終エタノール濃度を使用することもできます。このステップでは、イメージング中の気泡の形成や体積の増加を避けるために、組織内に存在する遊離ガスや溶解ガスを除去するために脱気を実行する必要があります。人間の臓器については、臓器の脆弱性に応じて脱水と脱気の 2 つの方法を紹介します。真空脱気 (ステップ 4A(i ～ v)) は、ほとんどの臓器 (心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓) に使用できます。臓器を室温 (20 °C) で 50%、60%、70% の濃度の事前に脱気したエタノール浴に 4 回連続して浸し、次に 2 番目の 70% 浴に浸して平衡に達することを確認します。脱気ステップは浴の間に実行されます。肺や心臓などの人間の臓器では、通常、各濃度で 4 日間で平衡に達します。脱気は、真空ポンプとデシケーターを使用して、15 ～ 10 mbar の絶対圧力まで連続的に下げて実行されます。 10 mbar で強い泡立ちが観察されない場合、脱気は適切であると考えられます。あるいは、気泡を見つけることができなかった場合、真空脱気法 36 を使用した後に何らかの損傷が観察されたため、熱サイクル (室温から 4 °C の間) (ステップ 4B(i)) が人間の脳などの壊れやすい器官向けに開発されました。脳から抜け出す方法。この方法では、器官を 50%、60%、70% の 4 つの連続した浴槽と、2 番目の 70% の事前に脱気したエタノールに浸すことによって、4 つの熱サイクルが実行されます。各熱サイクルは、室温で高度に脱気したエタノール浴に臓器を浸すことから構成されます。空気の泡が入らないように注意して容器を閉める必要があります。その後、冷蔵庫に 4 °C で 4 ～ 5 日間保管します。この間に、溶解ガスは周囲のエタノール中に拡散し、気泡は徐々に溶解していきます。この時間が経過したら、溶液と臓器を室温に戻す必要があり、事前に強力に脱気した新しいエタノール浴を使用して新しいサイクルを開始できます。どちらの方法でも、実質的な収縮を起こさずに最終濃度 70% に達するには、エタノール浴の最小数は 4 です。浸漬時間は臓器の種類と脆弱性に適応させて最適化する必要があります。脱気の結果は、後述する封入剤を使用せずに、瓶内の臓器の X 線写真を作成することでテストできます。残りの泡がまだ見える場合は、70% のエタノールを使用してさらに熱サイクルを実行できます。脳などの脂肪組織を含む臓器は、エタノールで平衡化するのに長い時間がかかります。各段階で、器官が入った容器をかき混ぜ、周囲のエタノール溶液に形成される異なる密度（異なる透明度）の縞を探すことによって脱水状態をチェックできます。これは、エタノール中に水が存在することを示します。

位相差を使用する場合、µCT および sCT で目的の構造を観察するには、エタノール脱水で十分です。ただし、サンプルの特定の成分を分解するため、または感度の低いイメージング技術を使用する場合には、このプロトコルと造影剤の使用を組み合わせることは可能であるはずです56。造影剤は 70% エタノールと混和性であるか、エタノール脱水の前に固定臓器に適用する必要があります。造影剤はサンプルの吸収を増加させるため、強力なシンクロトロン X 線ビームを使用する場合、イメージング中に気泡の形成が促進される可能性があります。

特性評価技術がエタノールと互換性がない場合 (拡散用 MRI など)、所望の濃度のホルマリンを含む水を使用して、脱気とマウントに同じプロトコルを適用できます。生物学的条件に近い条件を必要とする現場アプリケーションの場合、このプロトコルは水のみでも使用できますが、生物学的分解が起こるため、サンプルは数時間しか使用できません。ホルマリンやエタノールの溶液は危険な蒸気を発生させるため、特定の安全面（換気の良い実験室の換気フードの下で作業すること、手袋、白衣、閉じた靴、安全メガネを着用すること）を講じる必要があります。

湿式埋め込みにおける主な問題の 1 つは、気泡の存在です。これらは、封入プロトコル (臓器内の気泡または封入剤に閉じ込められたもの) および/またはエタノールの蒸発を引き起こす非常に高い X 線線量 (sCT の場合) に起因する可能性があります。どちらの場合も、かなりのアーチファクトが生じる可能性があり（図 3）、X 線量による泡立ちの場合、スキャン中の泡の動きによってスキャンが使用できなくなることがよくあります 60,61。予備テストでは、イメージング前にサンプルを脱気すると、閉じ込められた気泡が除去され、新しい気泡の核形成と成長が遅れることが示されました。したがって、気泡の形成を軽減するために、いくつかの脱気ステップがプロトコルに組み込まれました。

a ～ d、放射線量 (a、b) または取り付け中に閉じ込められた安定した気泡 (c、d) によるアーティファクト。 a, 数時間にわたってビームを照射した状態でスキャンがクラッシュし、画像にアーチファクトが生じたため、線量摂取量が多すぎるために発生した多数の気泡を含む人間の肝臓の断面図。ああ、バブルアーティファクト。 b、真空脱気でサンプルを脱気して気泡を除去した後に撮影された肝臓の断面図。 c、取り付け中に気泡が閉じ込められた人間の脳の断面図。 d. 脳内に閉じ込められた泡の拡大図。画像は ESRF の BM05 ビームラインで取得されました。すべての実験は、人体実験に関する関連する政府および機関の倫理規制に従って行われました。

このステップの目的は、スキャン中に臓器を所定の位置に維持して動きによるアーチファクトを回避し、後続のスキャン/実験間で良好な 3D 剛性位置合わせを行い、後の段階でより多くのスキャンを実行できるようにすることです。寒天ゲルは 70% エタノールで直接調製することはできませんが、撹拌した熱脱塩水 (約 85 °C) に寒天粉末を最大 20 g/L までゆっくりと加えて調製する必要があります。完全に溶解したら、寒天溶液を適切な容器に注ぎ、数時間冷まします。ゲル化したら、混合物を小さな立方体に切断し (ステップ 8)、96% エタノール (6 L:2 L エタノール:寒天) に加え (ステップ 9)、最終エタノール濃度が 70% になるようにします。脱気（ステップ 12）し、寒天キューブの一部を粉砕（ステップ 14）した後、混合物の準備が整います。エタノールよりもホルマリンによる封入が好ましい場合（たとえば、MRI のコントラストを向上させるため）、96% エタノール浴を 4% ホルマリン浴に置き換えることができます。寒天ゲルは、脱気後の溶液へのガスの再導入を防ぐために、事前に調製して気密容器に保管できます。準備する量は、最終的に装着する臓器や容器の大きさに応じて異なります。 70% エタノールで調製された寒天ゲルにより、イメージング中の気泡の形成が大幅に減少します。混合ゲルは粉砕寒天ゲルほどサンプルをしっかりと保持せず、イメージング中に動きを引き起こす可能性があるため、混合ゲルではなく粉砕寒天ゲルを使用することが重要です。当初は、サンプルを所定の位置に保持するために寒天キューブのみが使用されていました。しかし、立方体は硬すぎることが判明し、肺などの柔らかい器官の表面に接触すると変形が生じました。したがって、キューブはコンテナの底部と上部にのみ使用してください。数センチメートルを使用して固体のベースを作成し、サンプルの回転を防ぎます (ステップ 16)。砕いた寒天は、サンプルを所定の位置に維持するために容器の残りの部分に使用されます。封入液（70％エタノールまたは4％ホルマリン）中の砕いた寒天の混合物は、プロセス中に気泡が閉じ込められるのを避けるために、ひしゃくを使って容器に静かに加える必要があります（図4c）。寒天破砕ゲルを添加するときは、閉じ込められた気泡を除去するために、急速真空脱気を少なくとも 3 回実行する必要があります。これらの真空サイクルは、理想的には 15 mbar まで実行する必要があります。 X 線ビームが通過する物質の量を最小限に抑えるために、容器の寸法はできる限り試料に近づける必要があります。ただし、再構成の精度を損なう画像内のアーチファクトを避けるために、臓器は容器の側面に触れないようにしてください（つまり、容器との直接接触を避けるために、最低 5 mm の砕いた寒天ゲルで臓器を囲む必要があります）。。 sCT の場合、取り付けに使用する容器は、ポリエチレンテレフタレートなど、X 線に耐性があり、密度が高すぎない素材で作られている必要があります。ガラスは、サンプルに比べて密度が高いため、強い吸収コントラストアーチファクトが発生するため、避けてください。寒天ゲルがサンプルの周囲に圧縮され（ステップ 22）、適切に脱気されたら、容器を液密の蓋で密閉します（ステップ 28）。容器内でサンプルが動かず、内部に気泡が見られないことを確認するために、取り付けを評価する必要があります。いくつかの気泡が閉じ込められている場合は、急速真空脱気を使用して気泡を除去できます。 sCT スキャン中の高線量による泡立ちイベントの場合、同じアプローチを使用して臓器内の泡を除去することができます (密閉容器のガス抜きを行わず、蓋を外し、寒天ゲルの上に平らで硬いふるいを置きます)。臓器の動きを確認してから脱気し、エタノールレベルが低下した場合は補充し、最終的には少量の砕いた寒天ゲルを追加し、再び閉じます）。圧縮が不十分な寒天の例は、オンラインの補足ビデオ 1 に示されています。臓器を固定して 70% エタノールに入れると、サンプルは何年も保存できます (図 4d)。

a. デシケーターと真空ポンプを使用して、容器内の臓器を脱気します。 b、c、容器内の寒天ゲルを圧縮した後、シリンジとふるいを使用してエタノールの一部を除去し(b)、次に寒天ゲルを添加します(c)。このプロセスは、寒天ゲルがサンプルの周りで十分に圧縮されてサンプルが所定の位置に保持されるまで続けられます。 d. マウントされたサンプルは寒天ゲル内で安定化および脱気され、スキャンの準備が整いました。 e、密封容器内に砕いた寒天ゲルと寒天立方体で固定された、dと同様のマウントされた脳の概略図。すべての実験は、人体実験に関する関連する政府および機関の倫理規制に従って行われました。 CC BY 3.0 ライセンスの下でライセンス供与された Smart Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) のパネル e の脳の画像。

X 線イメージングと 3D 再構成については、このプロトコルでは詳しく説明されていません。ただし、詳細な説明は文献 36 で入手するか、対応する著者に連絡することで入手できます。この方法は、HiP-CT を使用した大型臓器イメージング用に開発されましたが、エタノール調製に関連した固定化やコントラスト増強など、より古典的な sCT および μCT (実験室ソース) イメージングでのより小さなサンプルのイメージングにも多くの側面が有益です。サンプルをマウントすると、いつでもスキャンを実行でき、図 2 に示す無傷の人間の心臓の典型的な sCT イメージング結果が得られます。この技術の主な制限は、高線量の適用後の気泡の核形成と成長です。 sCTの場合は臓器のX線撮影。イメージング中に気泡が数個しか現れない場合は、サンプルを 4 °C の冷蔵庫に放置すると、気泡が再び溶解します。これが成功しない場合は、サンプルを取り外すことなく真空ポンプで再度脱気することができますが、プロセス中にサンプルの小さな動きが必然的に発生するため、多重解像度のスキャンとレジストレーション手順が複雑になります。 sCT中の気泡の形成を回避するため、検出の最適化、より低い線量で機能する相対コントラストの増加、線量のより良い制御、より良いデータ処理、または同じスキャンの連続スキャン間にサンプルの休止期間を設けるなど、いくつかの解決策が存在します。エリア。泡立ちは、エタノールの蒸発速度に対する用量の熱効果に強く関係しているようです。より低い温度で動作するようにサンプル環境チャンバーを開発し、より良好な熱平衡を確保することは、特に同じ臓器に対する複数のサブミクロン解像度のスキャンの場合、70% エタノールの使用に伴う泡立ちのリスクを軽減する効果的な方法である可能性があります。

このプロトコルで提示されるサンプル調製方法は、MRI (図 5c) と互換性があり、マルチモーダルな研究に非常に適しています。ただし、サンプルの準備方法とスキャン順序を決定する前に、いくつかの考慮事項を考慮する必要があります。エタノールによるサンプルの脱水は X 線イメージングのコントラストを高めますが、MR 画像に影響を与える可能性があります 62。 MR 技術の大部分は水分含有量に大きく依存します。したがって、サンプルを脱水することにより、水をよく保持する組織（脂肪組織など）と効率的に脱水する組織（筋肉組織など）との間のコントラストが強調されます。ただし、総水分量を減らすと信号が減少し、拡散強調 MR などの一部の技術は使用できなくなります。この問題を克服する 1 つの方法は、サンプルを脱水せず、最初に MRI を実行するためにサンプルをホルマリンマウントで直接準備することです。 sCT 画像のコントラストは低下しますが、MRI 画像の信号対雑音比は増加します。ホルマリンまたはパラホルムアルデヒドで固定された組織は、生体外 MRI で最もよく使用されるサンプル前処理方法ですが、この技術は画像の品質にも影響します 63。ホルマリンまたはパラホルムアルデヒドで組織を固定すると、組織の T1、T2、拡散率が低下するため、画像のコントラスト対ノイズが低下します。 1 つのアプローチは、MRI イメージングの前に脳を洗浄して固定剤を除去することです。これにより、T1 ではなくても固定前の T2 値を回復できます (参考文献 64)。洗浄により、先行する脱気ステップも損なわれるため、各イメージングモダリティの相対的な重要性を、イメージングパイプライン全体およびマルチモーダルレジストレーションの要件と照らして慎重に比較検討する必要があります。

a、人間の腎臓の 3D ビュー。 b. 医療用 CT で撮影された腎臓の断面図 (ボクセルサイズは 625 μm)。 c、3T 医療用 MRI で撮影された腎臓の断面図。ボクセルサイズは 220 × 200 × 200 µm3 です。 d、BM5 ESRFビームライン上のボクセルサイズ25μmのsCTで画像化された腎臓の断面図。 e、sCTとヘマトキシリン・エオシン（H&E）で染色した病理組織切片の比較。組織学は、他のすべての画像診断法の後に実施されました。使用される組織学的技術は標準的であり、参考文献に十分に文書化されています。 72. 左の列は、H&E 染色した病理組織切片の光学顕微鏡画像を示し、右の列は、ESRF の BM05 ビームラインで撮影されたボクセルサイズ 1.4 μm の 2D sCT 画像を示します。左上に星が付いた画像は、疑似カラー化されているか（sCT から）、コントラストが反転される前にグレーレベルに変換されています（組織学から）。この臓器の起源となる患者に関するすべての基本情報は、拡張データ図 2 に示されています。すべての実験は、人体実験に関する関連する政府および施設の倫理規制に従いました。パネル e は参考文献の許可を得て改変したものです。 36、シュプリンガー・ネイチャー・アメリカ社

ここで概説するプロトコルには、人間または動物の臓器の取り扱いに関する事前の経験が必要です。人間の臓器が使用される場合、遺体の防腐処理と臓器の解剖を行うために病理学者が研究に参加する必要があります。臓器の脱気、寒天溶液の調製、および臓器の取り付けには、ホルマリンやエタノール溶液などの危険物の取り扱いが含まれるため、検査技師の専門知識が必要です。このプロトコルは、大きな臓器のイメージング用に開発および最適化されています。このような大きな構造のイメージングは簡単ではないため、CT または sCT の経験を持つ科学者が必要です。

ここでのすべての実験は、ESRF、フランセーズ解剖学研究所、およびハノーバー医学大学ハノーバー病理学研究所によって承認されました (倫理投票番号 9022_BO_K_2020)。輸送および画像化プロトコルは、保健研究機関および統合研究アプリケーションシステム (200429) およびフランス保健省によって承認されました。すべての臓器解剖は故人の記憶を尊重しました。死後研究は、死体研究の品質評価スケールの推奨事項に従って実施されました65。

研究におけるヒト組織の使用に関する機関および政府の倫理規制は、このプロトコルに記載されている手順を実行する前に求められ、従わなければなりません。具体的な要件は関係当局によって設定されます。通常、献体またはバイオバンクから適切なサンプルを特定した後、倫理委員会がプロジェクトを審査する必要があります。プロジェクトが承認されたら、施設間で生体標本を転送するための契約および/または材料転送協定 (MTA) を確立する必要があります。倫理的合意と MTA を取得するまでにかかる時間は、関係する国や契約の特殊性によっては、かなりの期間 (数週間から数年) かかる場合があります。

提供された遺体から得られた人間の臓器

科学研究のための人間の使用に関する機関および政府の倫理規制に従わなければなりません。

4% 中性緩衝ホルマリン (50% Hygeco、カタログ番号 07040 + 50% Hygeco、カタログ番号 07020; 4% に希釈)

有毒、発がん性、変異原性、生殖毒性、引火性があります。ドラフト内で慎重に扱ってください。吸入したり、皮膚や目への暴露を避けてください。

エタノール 96% (Cheminol France、カタログ番号 20× 4-2)

寒天寒天 (Nature et Aliments、カタログ番号 510190)

寒天のゲル化特性は生産者によって異なります。ここに示されている結果を再現するには、リストされているサプライヤーを使用することをお勧めします。他のものを使用する場合は、いくつかの予備テストが必要になります。

脱塩水 (Sigma Aldrich、カタログ番号 38796)

ドラフト (イベリス研究所、カタログ番号 SPR18)

手袋ニトリル (ショーワ、カタログ番号 7500PF)

ペーパータオル (Paredes、カタログ番号 404857)

解剖器具 (Fisher Scientific、カタログ番号 11738551)

真空ポンプ (Marshall Scientific、カタログ番号 VME8)

真空デシケーター（SP Bel-Art、カタログ番号 F42400-4031）

冷蔵庫 (Fisher Scientific、カタログ番号 22651264)

ポリエチレンテレフタレート製の大型漏れ防止容器 (拡張データ図に示す Medline Scientific、カタログ番号 129-0592、または Lock & Lock、カタログ番号 INL-403、または Lock & Lock、カタログ番号 INL-203) 4)

加熱プレートを備えた磁気渦システム (Fisherbrand、カタログ番号 15349654)

電動おろし金 (Seb、カタログ番号 DO201141)

おたま (ティファール、カタログ番号 K1180214)

ロングナイフ (イケア、カタログ番号 402.947.22)

シリンジ 50 ml (PentaFerte、カタログ番号 002022960)

ふるい (Profilstore、カタログ番号 toilinox_PGRI1ME213)

汎用ビニールテープ（3M、カタログ番号764）

ドリル (DeWALT、カタログ番号 DCD791P2-QW)

コンテナホルダー (カスタムメイド、拡張データ図 5 および参考資料 36 に記載)

シンクロトロンマイクロトモグラフィーのセットアップ。 ESRF の BM05 および BM18 ビームラインを使用しました。この論文で提示されているすべての臓器スキャンのビームラインパラメーターの詳細は、拡張データ図 6 に示されています。

データ再構築: Dell EMC PowerEdge R7525 ラックサーバー (オペレーティングシステム: Ubuntu 20.04.3 LTS、中央処理装置: AMD EPYC 75F3 2.95 GHz、64 コア、メモリ: DDR4-3200 32 GB (32x)、グラフィックスプロセッシングユニット: NVIDIA Ampere A40 ×2、ハードドライブ: 2.4 TB 10 K RPM SAS 12 Gbps)

データ視覚化: Dell Precision 7920 Tower (オペレーティングシステム: Windows Server 2016、中央処理装置: Intel Xeon Platinum 8160 M プロセッサ、2.10 GHz、24 コア、メモリ: 1.5 TB、グラフィックスプロセッシングユニット: NVIDIA Quadro P6000、ハードドライブ: AVAGO MR9460) -16i SCSI 4.67 TB)

MATLAB 2017 を使用して社内で作成された再構築コードは GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon) で入手できます。

ESRF によって開発された PyHST2 (3D 断層撮影再構成コード、http://ftp.esrf.fr/scisoft/PYHST2、オープンソース)

ImageJ/Fiji (データの前処理および後処理、https://imagej.nih.gov/ij/、http://fiji.sc/、オープンソース)

VGSTUDIO MAX バージョン 3.5 (ボリュームのセグメンテーションと視覚化、https://www.volumegraphics.com/en/products/vgsm.html)

人間の臓器の使用を伴う実験は、関連する機関または政府の委員会によって倫理的に承認されなければなりません。

提供された身体から臓器を抽出する (オプション A) か、バイオバンク、手術、移植を中止する (オプション B) ことによって目的の臓器を収集します。

遺体の防腐処理と臓器摘出

タイミング ~3 日

(オプション) ラノリンを含む溶液で 1.15% に希釈したホルマリン 4,500 ml、および 1.44% に希釈したホルマリン 4,500 ml を右頸動脈に順次注射し、死後の遺体を防腐処置します (資格のある医師が実施します)。理想的には頚静脈のドレナージを行います。。

ホルマリンは揮発性があり、非常に有毒です。これは目、呼吸器、皮膚への刺激性があり、発がん性物質である可能性があります。換気の良い場所の化学ドラフト内で作業し、適切な個人用保護具 (手袋、保護眼鏡、白衣) を着用してください。

本体は適切に固定して冷蔵保存した場合、最長 2 年間保存できます。

身体から目的の臓器を抽出します。

周囲の脂肪と結合組織を除去します。

バイオバンクからの臓器調達

タイミングは管理上および配達の遅延によって異なります

バイオバンク、手術、または却下された移植から臓器を回収します。臓器の回収とホルマリン固定の間の時間は最小限でなければなりません。その間、組織の分解を避けるために臓器は 4 °C に保つ必要があります。ドナーデータは政府規制に従って匿名化する必要があります。臓器は密閉した容器に入れて輸送する必要があります。

タイミング4d

(オプション) 室温で 4% 中性緩衝ホルマリンに浸漬して臓器を完全に固定します。病原体（新型コロナウイルス感染症など）の場合の解剖に関連する安全規則を遵守するために、ホルマリンによる固定に4dを使用しました。ホルマリンの量は臓器の体積の少なくとも 4 倍にすることをお勧めします。体積は病理学者によって推定され、これが標準的な方法です。

真空ポンプによる脱気は、ホルマリンやエタノールガスの吸入を避けるために、換気フードの下、または十分な能力の換気システムを備えた部屋で実行する必要があります。

室温は通常 20 °C に設定されました。

(オプション) サンプルを水道水で 2 分間洗浄して、固定剤を除去します。

エタノールの複数の浴を使用して脱水し、真空下で脱気することによって、マウント用の器官を準備します (オプション A)。真空脱気プロトコルでは、一部の壊れやすい臓器 (通常は脳) に損傷が見られる可能性があります。したがって、真空脱気を行わずにサンプルを調製するための代替プロトコルが、熱サイクルを使用して開発されました (オプション B)。 MRイメージングや生物学的条件に近いコントラストのX線イメージングの場合など、望ましくないサンプルの脱水を避けるために、エタノールを4%ホルマリン溶液に置き換えることができます。サイクルのタイミングと数は臓器の組成とサイズに大きく依存するため、この手順の変更が必要になる場合があります。サンプルの起源、タイプ、サイズが異なる場合は、このステップの最適化を考慮する必要があります。

脱水・真空脱泡

タイミング16日

あらかじめ脱気した 50% エタノールの浴槽に臓器を浸します。溶液は臓器の体積の少なくとも 4 倍でなければなりません。

臓器の入った容器をデシケーター内に置きます

強い泡立ちが起こるまでダイヤフラム真空ポンプを使用して圧力を連続的に下げ、組織内の遊離ガスと溶解ガスを除去します。

最初のサイクルの長さは通常 2 ～ 3 分で、心臓や腎臓などの人間の臓器では 3 ～ 4 サイクル後に 15 ～ 30 分に達します。

これらの時間は、ユーザーの掃除機構成に大きく依存します。

強い泡立ちが起こらないように、15 ～ 10 mbar に達するまでこれらのサイクルを続けます。

脱気は、サイクル時間を長くして実行する必要があります。各サイクルにおいて、泡立ちの強度が突然強くなった場合には、真空排気を停止します。新しいサイクルが開始されるたびに、最初の気泡が形成されるまでの時間が増加します。脱気時間は、臓器の構成とサイズに応じて各臓器に適合させる必要があります。典型的な時間というものはなく、バブル状態を見て経験的に選択する必要があります。これは真空ポンプとデシケーターの品質に大きく依存します。

トラブルシューティング

平衡になるまで待ちます (私たちのテストでは、肺、心臓、脳などの人間の臓器では、各エタノール濃度に対して通常 4 日間で十分であることが示されています。2 日間のみでは、不完全な平衡がスキャンの密度勾配として確認できました)。

60%、70%、最後に 70% の事前に脱気したエタノールの 3 つの連続した浴でステップ (i ～ vi) を繰り返し、各浴の間に脱気を行います。

マウントジャー内の寒天粉砕ゲルで臓器をマウントする直前に、数分間臓器の最終脱気を実行します。

脱水と熱サイクルによる脱気（脆弱な臓器の代替プロトコル）

タイミング 27 日

少なくとも 4 回の熱サイクルを、それぞれ 50%、60%、70%、70% のエタノール濃度で順次実行する必要があります。

連続する濃度ごとに、真空ポンプを使用して、臓器の体積の少なくとも 4 倍の体積のエタノールを室温で脱気します。

サンプルの入った容器にエタノールを加え、気泡が入らないように注意して容器を閉めます。

4 °C で 5 日間保管します。溶解したガスは周囲のエタノール中に拡散し、泡は徐々に溶解します。浸漬時間は臓器の種類と脆弱性に適応させて最適化する必要があります。

サイクルごとに、容器を冷蔵庫から取り出して室温に戻します (約 12 時間)。温度計を使用して溶液の温度を測定できます。

脱気の結果は、後述する封入剤を使用せずに、瓶内の臓器の X 線写真を作成することでテストできます。残りの泡がまだ見える場合は、70% のエタノールを使用してさらに熱サイクルを実行できます。脳などの脂肪組織を含む臓器は、エタノールで平衡化するのに長い時間がかかります。

70% エタノールに入ると、臓器はプロトコルのマウント手順を続行する前に、数か月から数年間室温で保存できます。

トラブルシューティング

タイミング 12 時間から 2 日

以下により 5 L の寒天ゲルが生成されます。

磁気渦システムを備えたホットプレートを使用して、容器内で 5 L の脱塩水を沸騰させます。

熱湯や蒸気は重度の火傷を引き起こす可能性があります。満杯の容器を手で運ばないでください。代わりに、カートまたは台車に乗せて転がしてください。安全装備（手袋、白衣、閉じた靴、安全メガネ）を使用し、換気の良い部屋で作業してください。

80°を超えたら、100 g の寒天 (20 g/L) 粉末を水にゆっくりと注ぎ、よく溶けるまでボルテックスを続けます。

溶けたら撹拌を止め、お玉でスターラーを取り外します。

液体を大きな容器に注ぎます。通常は40×30×12cmの容器を使用します。

熱湯や蒸気は重度の火傷を引き起こす可能性があります。安全装備（手袋、白衣、閉じた靴、安全メガネ）を使用し、換気の良い部屋で作業してください。

ゲル化が完了したら (温度に応じて約 12 時間)、長いナイフで寒天ゲルを約 2 cm3 の立方体に切ります。

ナイフは慎重に使い、常に自分がやっていることに集中してください。

20 L 容器内の 11.7 L の 96% エタノールにキューブを浸します。体積比は、最終エタノール濃度が 70% になるように選択されます。サンプルの脱水を避けるためにエタノールの代わりに 4% ホルマリン溶液を使用して臓器を調製した場合は、96% エタノールを 4% ホルマリンに置き換えます。

エタノールは引火性があるため、熱源から遠ざけ、常に消火器をそばに置いてください。エタノールまたはホルマリンの取り扱いは、常に換気フードの下で行う必要があります。吸入したり、皮膚や目への暴露を避けてください。安全装備（手袋、白衣、靴を閉じた状態、安全メガネ）を使用してください。ブロックの密度がエタノールの密度に近づくまで待ちます（約 24 時間）。

溶液をかき混ぜてゲルキューブを懸濁させ、ゲルキューブが容器の底にゆっくりと（数十秒かけて）沈むことを確認して、溶液の平衡を確認します。

角寒天とエタノールの入った容器をデシケーターに置きます。デシケーターを閉めるときは、蓋をして、軽い力でゆっくりと閉めてください。蓋を慎重に両方向にひねって、気密シールを確保します。デシケーターが真空ポンプに接続されていることを確認してください。

寒天立方体のひび割れを避けるために、真空ポンプを使用して約 1 時間の 2 サイクルで溶液を脱気します。脱水を避けるために、プロセス中はキューブを水に浸したままにしておく必要があります。キューブを 10 分以上空気にさらさないでください。エタノール 70% を含む脱気キューブの 3 分の 1 を気密容器に保管します。

電動おろし金を使って残りの立方体を粉砕します。

70% エタノールを含む電気機器の使用は火災の危険性があるため、問題の電気機器には火花保護機能を備えたモーターが搭載されており、適切な火災規制に従う必要があります。

将来使用するために、寒天が溶液から漏れないよう十分な 70% エタノール溶液とともに気密容器に保管します。

使用直前に溶液を再度脱気します。

タイミング ~3 時間

漏れ防止の円筒形容器の底に、長さ/幅が数センチメートルのアガロースキューブを入れます。コンテナを拡張データの図 4 に示します。

容器の半分に砕いたジェルを入れます。

寒天溶液を操作するときは、溶液中の溶存ガスの増加や気泡の閉じ込めを避けるために、取鍋を慎重にゆっくりと動かします。

慎重に臓器をゲルに浸し、イメージングのために目的の位置に置きます。臓器を砕いた寒天で覆います。

容器全体を脱気して、閉じ込められた気泡を取り除きます。

この脱気ステップは、閉じ込められた気泡を除去することのみを目的としています。すべてのコンポーネントは事前に脱気されているため、溶解ガスの量は制限されるはずです。この真空脱気は、目に見える気泡を除去するために、短いポンピング時間 (2 ～ 3 分) で数サイクルのみ実行する必要があります。

デシケーターを軽くたたくと、気泡が上部に移動しやすくなります。

寒天エタノール溶液をさらに加えます。

ふるいを使用して寒天ゲルを上から押し、臓器の周りに寒天ゲルを圧縮します。注射器を使用してふるいの上から余分なエタノールを取り除き、容器の 4 分の 1 に相当する量の寒天とエタノールを加えます。

寒天が固まると気泡が上に上がりにくくなり、容器のこの部分では脱気できなくなるので注意してください。寒天を圧縮するときに気泡が入らないように、すべての動作をゆっくりと注意深く行う必要があります。

手動でサンプルの周囲に垂直方向の圧力を加えて、サンプルの周囲の寒天を圧縮し、サンプルがジャー内で動かなくなるまでサンプルを所定の位置に維持します。

X 線イメージング中の境界効果を避けるために、サンプルと容器の壁の間に少なくとも 5 mm の粉砕寒天ゲルを残す必要があります。

真空ポンプを使用して容器全体を脱気し、最後の 3 つの手順で追加されたガスを除去し、寒天ゲル内に気泡が閉じ込められるのを防ぎます。気泡が抜けやすくなるようにサイクルを使用します。数サイクル後、検査で気泡が確認できない場合は、次のステップに進みます。

寒天がサンプルの下、周囲、上で十分にコンパクトになり、標本の動きが妨げられるまで、最後の 4 つの手順を繰り返します。圧縮が不十分な寒天の例は、オンラインの補足ビデオ 1 に示されています。

トラブルシューティング

漏れ防止容器の上部まで寒天エタノール溶液を満たし、サンプルを確実にブロックするために溶液を入れた寒天キューブをいくつか入れて完了します。

蓋の中央に直径数ミリの小さな穴を開けます。

容器の蓋をねじ込みます。

容器が直接密閉されていない場合は、容器のネジ部にパラフィルムラテックスやシリコンゴムなどのシール材を使用して、確実に密閉してください。

密封後、蓋に軽く圧力を加え、穴からエタノールが出てくることを確認して、容器からすべての空気が除去されていることを確認します。

寒天が穴を塞いでエタノールが出なくなる可能性があります。その場合は針を使って穴を空けてください。

蓋の穴にテープを貼り、容器の内側と外側の間でのガス交換を防ぎ、スキャン中に泡が発生した場合の安全排気として機能します。

蓋を保護し、誤って開かないように蓋の周りにテープを貼ります。

容器内に泡が残っていないことを確認します。寒天が緻密になると、泡は容易に上部に移動できなくなります。

取り付けられた臓器は、撮影前に数か月から数年間室温で保存でき、高すぎる X 線量による泡立ち現象がない限り、介入なしで何度でも撮影できます。

トラブルシューティング

タイミングはイメージング設定に応じて変化します

この論文で提示されているすべての臓器スキャンのビームラインパラメーターの詳細は、拡張データ図 6 に示されています。その他のセットアップパラメーターの例については、Walsh et al.36 を参照してください。ステップ 37 ～ 43 は、十分な訓練を受けたシンクロトロンビームライン科学者が実行する必要があります。

冷蔵されマウントされた臓器の場合は、温度変化によるイメージング中の形状の変化を避けるために、実験の少なくとも 12 時間前に臓器を冷蔵庫から取り出し、室温に放置します。

容器ホルダー上の密閉容器に臓器を置きます。弊社で使用している特注コンテナホルダーを拡張データ図5に記載しております。

エタノール寒天ゲルなどの適切な封入剤のみを充填した 2 番目の同等の容器 (参照容器と呼ばれます) をサンプル容器の上に置きます。

臓器全体を画像化できるピクセルサイズで検出器を設定します。通常、水平方向に 5,056 ピクセルのカメラを備えた 14 cm の脳の場合、通常の取得では最大ピクセルサイズ 27.7 μm を達成できます。

検出器を X 線ビームに合わせます。

ビームラインのスリットを、視野の周りの開口部を設定して調整します。

適切にフィットしたスリットにより、サンプルに堆積する線量が減少します。

サンプルを検出器に合わせて回転の中心を見つけます。

エネルギーと流束を調整して、サンプルへの十分な浸透を確保します。最適な平均エネルギーは、臓器が入っている瓶のサイズによって異なります。通常、10 cm で 80 keV、特に軟骨や石灰化などの密度の高い部分が X 線写真で見える場合は、15 cm で最大 110 keV です。光束を調整して、正しいエネルギー範囲内にあり、気泡を避けるために十分に低い線量率を維持しながら、実験要件に合わせてスキャン速度を調整できます。

スキャン中の気泡の形成を避けるために、サンプルに堆積する線量には注意する必要があります。このステップは、訓練を受けたビームライン科学者が実行する必要があります。さらに、このステップは、サンプルの種類とサイズ、ビームラインの特性、サンプルの脱気の品質に大きく依存します。

カメラの露光時間と蓄積を設定します。通常、16 ビットでコード化されたカメラ信号の場合、単一サブフレームあたり 42,000 の最大ピクセル値により、カメラのダイナミックを最大限に活用しながら、飽和を回避するための強力なセキュリティマージンが可能になります。

露光時間を長くするとスキャン時間が長くなり、サンプルに付着する線量も長くなります。

カメラのダイナミクスが最適化されていること、およびスキャン中に検出器の飽和が発生していないことを確認してください。

参照コンテナのスキャンを実行します。

臓器全体をスキャンします。

リファレンススキャンとサンプルスキャンのビームラインセットアップは同一である必要があります。

トラブルシューティング

ステップ 44 で実行された参照スキャンのすべての投影の平均を実行して、フラットフィールドを作成します。

ステップ 46 で計算されたフラットフィールドを適用し、単一距離位相検索と組み合わせたフィルター逆投影アルゴリズム 66 を使用してシングルスライス再構成を実行し、スキャンの品質を確保します (再構成は、オープンソースの断層撮影再構成を使用して実行できます) PyHST2 (ref. 67) や TomPy68 などのコード)。

(オプション) 再構成された画像上で関心のある特徴を選択します。

(オプション) モーターの位置を計算し、対応する関心領域をイメージングするためにサンプルを位置合わせします。

(オプション) 臓器内の選択した領域をイメージングするには、ステップ 37 ～ 47 を繰り返します。

サンプルスキャン X 線写真のフラットフィールド補正のために、100 投影ごとに参照スキャンから部分角度積分を作成します。

ステップ 50 で計算された対応するフラットフィールドを使用して、サンプルスキャンの 100 投影ごとにフラットフィールド補正を適用します。

単一距離位相検索66および2Dアンシャープマスクと組み合わせたフィルター逆投影アルゴリズムを使用して3Dボリュームを再構成します（再構成は、PyHST2（参考文献67）またはTomoPy68などのオープンソースの断層撮影再構成コードを使用して実行できます）。

(オプション) 更新された Lyckegaard et al.69 アルゴリズムを使用して、再構成されたスライスのリングアーティファクトを修正します (コードはコードの利用可能性セクションに示されている GitHub で入手可能です)。

タイミングはイメージング技術によって異なります

マウントされたサンプルを µCT19、臨床 CT70、71、または MRI63 で画像化します。サンプルは、これらのイメージング技術を必要なだけ使用してイメージングできます。

(オプション) 生体サンプルに対して組織学的分析を実行します。我々は、Ross と Pawlina で十分に文書化されている標準的な組織学的手法を使用しました 72。

トラブルシューティングのアドバイスは表 1 にあります。

ステップ 1、臓器の調達: ~3 日

ステップ 2、臓器の固定: 4 d

ステップ 3 ～ 4A または 3 ～ 4B、マウント前の臓器の準備: 16 ～ 27 d

ステップ 5 ～ 16、臓器固定用ゲルの準備: 12 時間～ 2 日

ステップ 17 ～ 32、臓器の取り付けとガス抜き: ～ 3 時間

ステップ 33 ～ 53、sCT イメージング: タイミングはイメージング技術とセットアップによって異なります

ステップ 54 ～ 55、イメージングと組織学: タイミングはイメージング技術とセットアップによって異なります

このプロトコルは、sCT、μCT、臨床 CT または MR イメージングを使用して高解像度でイメージングするための大きな臓器または生体サンプルを準備および安定化する方法を提供します。人間の臓器の典型的な画像を図 1 と 2 に示します。このサンプル前処理手順は、（イメージングモダリティに応じて）高コントラストの画像を提供し、スキャン中のサンプルの動きを防ぎ、複数のイメージングモダリティと互換性があり、パラフィンなどの他のサンプル前処理方法と比較して組織の形態学的特徴を保存します。埋め込み。サンプルは移動や劣化なしに少なくとも 1 年間保存できます。この方法により、人間の臓器などの大きな生物学的構造を損傷することなく 3D 調査することができます。これらの高解像度画像は、臓器の健康な特性または病理学的特性、たとえば人間の肺における新型コロナウイルス感染症の影響に関する定性的および定量的な情報を提供できます36。

このプロトコル文書に記載されている図を作成するために使用される画像データは、ESRF データリポジトリ (https://human-organ-atlas.esrf.eu) または対応する著者から公開されています。

sCT データは、GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon) で入手可能な MATLAB 2017 で書かれたカスタムコードとソフトウェアパッケージ PyHST2 (https://software.pan-data.eu/software/74) を使用して再構築されました。 /pyhst2)。ボリュームレンダリングには VGSTUDIO MAX 3.5 (ボリュームグラフィックス) を使用しました。

アルホ、EJLら。三次元顕微鏡による人間の皮質下の神経解剖学的構造を研究するための代替としての厚さの高い組織学的切片。脳の構造。機能。 223、1121–1132 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

コフラー、L.ら。原発性基底細胞癌の治療における三次元組織学と連続切片組織学: 569 個の腫瘍を対象としたランダム化、前向き、盲検研究。 J.ユーロ。アカド。ダーマトール。ベネレオール。 35、1323–1330 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pichat, J.、Iglesias, JE、Yousry, T.、Ourselin, S.、Modat, M. 3D 組織学再構成方法の調査。医学。アナル画像。 46、73–105 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Eberle, AL & Zeidler, D. コネクトミクス研究における高スループットイメージングのためのマルチビーム走査型電子顕微鏡。フロント。ニューロアナト。 12、112 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ヒルデブランド、DGC et al. ゼブラフィッシュ幼生の全脳連続切片電子顕微鏡観察。ネイチャー 545、345–349 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miranda, K.、Girard-Dias, W.、Attias, M.、de Souza, W. & Ramos, I. 生命科学における電子顕微鏡による三次元再構成: 細胞および組織生物学者のための入門。モル。リプロド。開発者 82、530–547 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

田井中和也ほか組織の脱色による単一細胞解像度の全身イメージング。セル 159、911–924 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhao, S. et al. 無傷の人間の臓器の細胞および分子の調査。セル 180、796–812.e19 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cai、R.ら。透明なマウスのパノプティックイメージングにより、全身の神経細胞の投影と頭蓋骨と髄膜の接続が明らかになります。ナット。神経科学。 22、317–327 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pailhé、R. et al. 全視野光干渉断層撮影法を用いた ex vivo での軟骨変性の定性的および定量的評価。変形性関節症。カルティル。 26、285–292 (2018)。

記事 Google Scholar

Raghunathan, R.、Singh, M.、Dickinson, ME & Larin, KV 胎児イメージングのための光コヒーレンストモグラフィー: レビュー。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．オプション。 21、1 (2016)。

記事 Google Scholar

Lefort, C. 生物医学用多光子顕微鏡とそのレーザー源の概説。Ｊ．Ｐｈｙｓ．応用物理学。 50、423001 (2017)。

記事 Google Scholar

Disney, CM, Lee, PD, Hoyland, JA, Sherratt, MJ & Bay, BK 生体外での軟組織微細構造の変形の可視化とひずみの定量化のための技術のレビュー: 軟組織微細構造の変形とひずみの定量化。Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ． 272、165–179 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schueder、F. et al. スピニングディスク共焦点顕微鏡と DNA-PAINT を使用した細胞全体の多重 3D 超解像度イメージング。ナット。共通。 2090 年 8 月 (2017 年)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Goth, W.、Lesicko, J.、Sacks, MS、Tunnell, JW 軟組織構造の光学ベースの分析。アンヌ。バイオメッド牧師。工学 18、357–385 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エドロウ、BLら。解像度 100 ミクロンの生体外人間の脳の 7 テスラ MRI。科学。データ6、244（2019）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Boazizi、K. et al. ex vivo MRI を使用したヒト左心房心筋における線維症、脂肪および脂肪線維症の区別と定量化。 PLoS ONE 13、e0205104 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Verleden, SE et al. 生理的に老化した肺における小さな気道喪失: 未使用のドナー肺における横断研究。ランセットレスピア。医学。 9、167–174 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

ウィザーズ、PJ et al. X線コンピュータ断層撮影。ナット。 Rev. Methods Primers 1、18 (2021)。

Mastrogiacomo, M.、Campi, G.、Cancedda, R.、Cedola, A. シンクロトロン放射線技術は、骨組織工学の研究を促進します。アクタバイオメーター。 89、33–46 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロンゴ、E.ら。 X線位相コントラスト断層撮影によるマウス脳転移におけるナノ粒子の3D空間分布。フロント。オンコル。 11、554668 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

フー、Y.、デイジー、G. & チェン、A.-S. Q&A: マルチスケールコネクトームマッピングにシンクロトロン X 線断層撮影法を使用する理由は何ですか? BMCバイオル。 15、122 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

横川和也ほか急性大動脈解離における大動脈壁のシンクロトロン放射に基づく X 線位相コントラスト画像化。 JVSバスク。科学。 1、81–91 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Y.、Nelson, J.、Holzner, C.、Andrews, JC、Pianetta, P. シンクロトロンベースの硬 X 線位相コントラストイメージングの最近の進歩。Ｊ．Ｐｈｙｓ．応用物理学。 46、494001 (2013)。

記事 Google Scholar

ゴンザレス・テンデロ、A. 他 X 線位相差シンクロトロン放射光ベースのマイクロコンピューター断層撮影による、心臓全体の詳細かつ定量的な解剖学的構造、筋線維構造、血管構造。ユーロ。ハート J. Cardiovasc. イメージング 18、732–741 (2017)。

論文 PubMed Google Scholar

Planinc, I. et al. シンクロトロン伝播ベースのX線位相コントラストイメージングによる虚血性心疾患における心筋リモデリングの包括的な評価。科学。議員 11、14020 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チン、A.-L. 他。大型動物の脳をマッピングするためのシンクロトロン X 線イメージング戦略。顎。Ｊ．Ｐｈｙｓ． 65、24–32 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Endrizzi, M. X 線位相コントラストイメージング。 Nucl. インストラム。方法物理学。解像度宗派。アクセル。分光計による検出。准教授装備する。 878、88–98 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

シュルツ、G.ら。人間の小脳の高解像度断層撮影イメージング: 吸収と回折格子ベースの位相コントラストの比較。 JR協会インターフェース 7、1665 ～ 1676 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

篠原G.らシンクロトロン放射光を使用した高解像度位相コントラスト CT イメージングによる、心臓全体の標本のヒト心臓伝導組織の 3 次元視覚化。 World J. Pediatr. 先天性。心臓外科。 7、700–705 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Westöö、C. et al. シンクロトロンベースの位相差マイクロ CT によって特定された、異なるタイプの叢状病変。午前。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．肺細胞。モル。生理。 321、L17–L28 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ボリソワ、E. 他マイクロメートル解像度の X 線断層撮影による、無傷の死後の幼若ラットの肺の全容積再構成。組織化学。セルバイオル。 155、215–226 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Broche, L. et al. 損傷したウサギの肺における位相コントラスト CT イメージングによって in vivo で特徴付けられる個々の気道閉鎖。クリティカル。ケアメッド。 47、e774–e781 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dutel, H. et al. シーラカンスの神経頭蓋発達と石棺頭部の進化。ネイチャー 569、556–559 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マンスーツ、R.ら。現生シーラカンス Latimeria chalumnae における胸帯と鰭骨格の発生と成長。 J.アナト。 236、493–509 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

ウォルシュ、CLら。階層的位相コントラスト断層撮影法を使用して、細胞構造を局所的に分解して無傷の人間の臓器をイメージングします。ナット。方法 https://doi.org/10.1038/s41592-021-01317-x (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Dias、CSB、Neto、DPA、Baraldi、GL & Fonseca、MC シンクロトロンベースの X 線マイクロトモグラフィーを使用した形態計測研究のための軟部生体組織のサンプル調製プロトコルの比較分析。 J.シンクロトロン放射。 26、2013 ～ 2023 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Li, T.、Schreibmann, E.、Yang, Y. & Xing, L. オンボードのコーンビームコンピューター断層撮影によるターゲットの位置特定を改善するための動き補正。物理学。医学。バイオル。 51、253–267 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sun, T.、Kim, J.-H.、Fulton, R.、Nuyts, J. 頭部 X 線 CT 用の反復投影ベースの動き推定および補償スキーム。医学。物理学。 43、5705–5716 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Topal、E. et al. Ni 発泡体上に整列した MoO2 立方体に固定された MoNi4 電極触媒を研究するためのマルチスケール X 線断層撮影および機械学習アルゴリズム。 BMCメーター。 2、5 (2020)。

記事 Google Scholar

Topal, E.、Löffler, M.、Zschech, E. 高解像度 XCT データの再構築における深層学習ベースの不正確さの補正。科学。議員 10、7682 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バーガー、M.ら。物理運動モデルに基づいた、アンダーサンプリングされた動的 X 線断層撮影のための変分再構成法。逆問題 33、124008 (2017)。

記事 Google Scholar

パッツェルト、M. et al. マイクロ CT における心臓および肺イメージングのためのエタノール固定法。日本Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ． 37、500–510 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アッカーマン、M.ら。新型コロナウイルス肺炎における気管支循環。午前。Ｊ．レスピア．クリティカル。ケアメッド。 205、121–125 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アッカーマン、M.ら。肺新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の致死的な経過は、小葉虚血と線維性リモデリングによって引き起こされます。 eBioMedicine 85、104296 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロジャース、G. et al. 固定とパラフィン包埋がマウスの脳の形態に及ぼす影響: 放射光に基づく断層撮影研究。プロセスで。 SPIE Developments in X-Ray Tomography XIII (Müller, B. および Wang, G. 編) 27 (SPIE、2021); https://doi.org/10.1117/12.2595144

ロジャース、G. et al. ホルマリン固定からパラフィン包埋までのマウス脳全体の仮想組織学。パート 1: データの取得、解剖学的特徴のセグメンテーション、全体的な体積と密度の変化の追跡。 J. Neurosci. 方法 364、109354 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Gusnard, D. & Kirschner, RH 走査型電子顕微鏡の準備中の細胞と細胞小器官の収縮: 固定、脱水、臨界点乾燥の影響。Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ． 110、51–57 (1977)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Metscher、BD 発生生物学用 MicroCT: 組織学的解像度での高コントラスト 3D イメージングのための多用途ツール。開発者ディン。 238、632–640 (2009)。

論文 PubMed Google Scholar

白井隆ほか位相差X線コンピュータ断層撮影におけるエタノール固定による腎臓画像のコントラストの向上。 J.シンクロトロン放射。 21、795–800 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wilke, H.-J.、Krischak, S.、Claes, LE ホルマリン固定は、脊椎の生体力学的特性に強く影響します。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ． 29、1629–1631 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Rouleau, L.、Tremblay, D.、Cartier, R.、Mongran, R. & Leask, RL 犬の下行大動脈組織の機械的特性の地域的差異は、ホルマリン固定によって変化します。心臓血管。パソル。 21、390–397 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

Vesper, EO、Hammond, MA、Allen, MR & Wallace, JM たとえ再水和したとしても、エタノール中での保存は骨の機械的性質と実験的操作に対する骨の反応に影響を与えます。ボーン 97、49–53 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マディ、Ｋら。シンクロトロン X 線断層撮影法による負荷を受けた関節全体のナノスケールひずみのその場特性評価。ナット。バイオメッド。工学 4、343–354 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

ジニャック PM et al. 拡散性ヨウ素ベースの造影コンピュータ断層撮影法 (diceCT): 後生動物の軟部組織を迅速かつ高解像度で 3D イメージングするための新しいツールです。 J.アナト。 228、889–909 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koç, MM、Aslan, N.、Kao, AP & Barber, AH X 線断層撮影造影剤の評価: 製造、プロトコル、生物学的応用のレビュー。マイクロスク。解像度技術。 82、812–848 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Metscher, BD 比較形態学用 MicroCT: シンプルな染色法により、石灰化されていないさまざまな動物組織の高コントラスト 3D イメージングが可能になります。 BMC フィジカル。 9、11 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Mittone, A. et al. ESRF-ID17 生物医学ビームラインでのマルチスケールピンクビームマイクロ CT イメージング。 J.シンクロトロン放射。 27、1347–1357 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Xian、RPら。人間の左肺全体のマルチスケール X 線位相コントラスト断層撮影データセット。科学。データ9、264（2022）。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サッコマーノ、M. et al. シンクロトロンインライン位相コントラスト µCT により、染色の有無にかかわらず、埋め込まれた軟組織サンプルの詳細な仮想組織学が可能になります。 J.シンクロトロン放射。 25、1153–1161 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スロットン、MC et al. 可逆的に染色された中枢神経系サンプルの相補的な軟組織シンクロトロン X 線マイクロトモグラフィーを最適化します。科学。議員8、12017（2018）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wereszczyńska、B. 高コントラスト死後 MRI 用のアルコール固定標本。フォレンジックイメージング 25、200449 (2021)。

記事 Google Scholar

Roebroeck, A.、Miller, KL & Aggarwal, M. 人間の脳の体外拡散 MRI: 技術的課題と最近の進歩。 NMRバイオメッド。 32、e3941 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Shepherd, TM、Thelwall, PE、Stanisz, GJ & Blackband, SJ アルデヒド固定溶液は神経組織の水緩和特性と拡散特性を変化させます。アルデヒド固定は組織の MRI 特性を変化させます。マグニチュードレゾン。医学。 62、26–34 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィルク、J.ら。死体研究の方法論的品質の評価: QUACS スケールの検証。 J.アナト。 226、440–446 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Paganin, D.、Mayo, SC、Gureyev, TE、Miller, PR & Wilkins, SW 均質な物体の単一の焦点のぼかされた画像からの位相と振幅の同時抽出。Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ． 206、33–40 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mirone, A.、Brun, E.、Gouilart, E.、Tafforeau, P. & Kieffer, J. 反復再構成とアプリオリ知識機能を備えた高速断層撮影再構成のための PyHST2 ハイブリッド分散コード。 Nucl. インストラム。方法物理学。解像度宗派。 Bビームインタラクト。メーター。 324、41–48 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Gürsoy, D.、De Carlo, F.、Xiao, X.、Jacobsen, C. TomPy: シンクロトロン断層撮影データの解析のためのフレームワーク。 J.シンクロトロン放射。 21、1188–1193 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Lyckegaard, A.、Johnson, G.、Tafforeau, P. X 線断層撮影画像におけるリングアーチファクトの補正。 Int J. ボリューム統計 18、1–9 (2011)。

Google スカラー

大石洋他 ex vivo 肺 CT 所見は、肺移植後の初期段階の結果を予測する可能性があります。 PLoS One 15、e0233804 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Verleden, SE et al. 未使用のドナー肺の放射線分析: 移植に対するドナーの受け入れを改善するツール? 午前。 J. 移植。 17、1912–1921 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ross, MH & Pawlina, W. 組織学: テキストとアトラス: 相関細胞および分子生物学を使用 (Wolters Kluwer、2020)。

リファレンスをダウンロードする

テスト段階での支援については S. Bayat (INSERM)、ドナーの遺体の解剖については P. Masson (LADAF)、プロジェクト全体の支援については H. Reichert (ESRF) と R. Tori、そして E. Boller, C に感謝します。セットアップの開発と改善については、Muzelle、R. Homs、C. Jarnias、F. Cianciosi、P. Vieux、P. Cook、L. Capasso、A. Mirone に感謝します。また、組織学と解剖についてご協力いただいた R. Engelhardt、A. Muller Brechlin、C. Petzold、N. Kroenke、M. Kuhel に感謝します。このプロジェクトは、シリコンバレーコミュニティ財団の助言基金であるチャン・ザッカーバーグ・イニシアティブDAFからの助成金番号2020-225394と、チャン・ザッカーバーグ・イニシアティブ財団からの助成金番号CZIF2021-006424、ESRF資金提案md1252およびmd1290によって部分的に可能になりました。王立工学アカデミー (CiET1819/10)。 PDL と CLW は、MRC からの資金提供に感謝の意を表します (MR/R025673/1)。 MA は、国立衛生研究所 (HL94567 および HL134229) からの助成金を認めています。この研究は、ドイツの COVID-19 解剖登録局 (DeRegCOVID、www.DeRegCOVID.ukaachen.de; 連邦保健省の支援: ZMVI1-2520COR201) と連邦教育研究省のネットワークの一環として支援されました。大学医学 (パンデミックの敗北、2021 年 10 月 1 日)。

これらの著者は同様に貢献しました: J. Brunet、CL Walsh。

ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン機械工学科、ロンドン、英国

J. ブルーネット、CL ウォルシュ、S. マルッシ、ピーター D. リー

欧州放射光施設、グルノーブル、フランス

J. ブリュネ & ポール・タフォーロー

ハイデルベルク大学病院、診断および介入放射線科、ハイデルベルク、ドイツ

WL・ワグナー

トランスレーショナル肺研究センターハイデルベルク (TLRC)、ドイツ肺研究センター (DZL)、ハイデルベルク、ドイツ

WL・ワグナー

フランスアルプス解剖学研究所 (LADAF)、グルノーブルアルプ大学、グルノーブル、フランス

A.ベリエ

ハノーバー医科大学病理学研究所、ハノーバー、ドイツ

C. ヴェレイン & DD ヨニク

末期閉塞性肺疾患における生物医学研究ハノーバー (BREATH)、ドイツ肺研究センター (DZL)、ハノーバー、ドイツ

DDヨニク

アントワープ外科トレーニング解剖学研究センター (ASTARC)、アントワープ大学、アントワープ、ベルギー

SE 過去

病理学および分子病理学研究所、ヘリオス大学クリニックヴッパータール、ヴィッテン/ヘルデッケ大学、ヴッパータール、ドイツ

M・アッカーマン

機能臨床解剖学研究所、ヨハネス・グーテンベルク大学マインツ医療センター、マインツ、ドイツ

M・アッカーマン

英国ディドコット、ハーウェルの研究施設

ピーター・D・リー

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PT、PDL、DDJ、MA、CLW、WLW はプロジェクトを概念化し、実験を計画しました。 MA、CW、PT、AB、SEV、CLW、JB が解剖とサンプル調製を実施し、貢献しました。 PT は機器を設計および構築し、HiP-CT イメージングを実行しました。 SM が設計したサンプルホルダー。 PT は断層撮影再構成法を設計および実装しました。 JB、PT、CLW、PDL が論文を執筆しました。著者全員が原稿のレビューと修正に協力してくれました。

J. ブルーネット、CL ウォルシュ、ピーター D. リー、またはポールタフォローとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Protocols は、この研究の査読に貢献してくれた Ali Erturk、Stuart Stock、上田広樹に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

このプロトコルを使用する主要な参照

ウォルシュ、CLら。ナット。方法 18、1532–1541 (2021): https://doi.org/10.1038/s41592-021-01317-x

アッカーマン、M.ら。私は持っている。 J. 呼吸します。クリティカル。どの医学。 205、121–125 (2022): https://doi.org/10.1164/rccm.202103-0594IM

アッカーマン、M.ら。 eBioMedicine 85、104296 (2022): https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104296

このプロトコルは、軟組織イメージング、線量蓄積、および局所断層撮影に関連するさまざまな課題をすべて克服する反復的な方法で開発されました。

心臓、腎臓、脳のデータは、Human Organ Atlas (https://human-organ-atlas.esrf.eu) にあります。肝臓のデータは、スキャン中の気泡形成により画像内に多数のアーチファクトが存在するため、Human Organ Atlas には含まれていません。ただし、画像は対応する著者からのリクエストに応じて入手できます。これらの気泡の形成は、ビームラインソフトウェアのクラッシュによりビームが数時間同じ位置に留まり、臓器の線量閾値を超えたために発生しました。他の肝臓はアーチファクトなしでスキャンされました。

このプロトコル文書に記載されているプロセスはすべての主要な臓器に機能するはずですが、ここにリストされている臓器のみがテストされています。ここに記載されている最大脱気時間は当社の真空脱気設定に固有のものであり、ポンプ、排気量、排気セクション、排気されるガスの量、およびガスが通過する経路によって変化する可能性があります。サンプルを残します。したがって、プロトコルのステップ 4A(ii) で説明されているように、泡立ちの強さを見て、各ユーザーの真空設定に適応させる必要があります。

左側の漏れ防止容器は、3 L の Medline Scientific 容器 (カタログ番号 129-0592) です。右側の漏れ防止容器は、2.1 L の Lock & Lock 容器 (カタログ番号 INL-403) です。両方とも拡張データ図 5 に記載されているカスタムメイドのコンテナホルダー内にあります。

カスタムメイドのコンテナホルダー内に 2 つのコンテナが表現されています。下部の容器にはサンプルが含まれており、上部の容器は参照容器と呼ばれ、フラットフィールド補正に使用されます。

最適なスキャン設定は、サンプル、ビームラインのセットアップと機器に大きく依存します。ここで示したパラメータは例として示されています。 4 分の 1 取得とは、半分の取得で 1 回のスキャンと、横方向の視野を拡大するための 1 回の環状スキャンを意味します。 Mo＝モリブデン。

圧縮が不十分な寒天を載せたサンプルの例。わずかな動きで回転が可能です。

Springer Nature またはそのライセンサー (協会や他のパートナーなど) は、著者または他の権利所有者との出版契約に基づいて、この記事に対する独占的権利を保持します。この記事の受理された原稿バージョンの著者によるセルフアーカイブには、かかる出版契約の条項および適用される法律のみが適用されます。

転載と許可

Brunet, J.、Walsh, CL、Wagner, WL 他マルチモーダルイメージング互換性を備えた高解像度、階層型シンクロトロン位相差トモグラフィーのための大量の生体サンプルの調製。 Nat Protoc 18、1441–1461 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 6 月 21 日

受理日: 2022 年 12 月 12 日

公開日: 2023 年 3 月 1 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。

前: ロンポック消防署、排気抽出システムの設置により消防士の安全性を向上次: 高所作業プラットフォーム市場の機会別、用途別、現在の傾向および予測2032年

お問い合わせを送信

送信